பிசிஆர், பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை, இது டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் வினையூக்கத்தின் கீழ் கணினியில் டிஎன்டிபி, எம்ஜி2+, நீட்டிப்பு காரணிகள் மற்றும் பெருக்க மேம்படுத்தல் காரணிகளைச் சேர்ப்பதைக் குறிக்கிறது, பெற்றோர் டிஎன்ஏவை டெம்ப்ளேட்டாகவும், குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களை நீட்டிப்பின் தொடக்க புள்ளியாகவும் பயன்படுத்துகிறது. denaturation, annealing, extension போன்ற படிகள் மூலம், பெற்றோர் strand வார்ப்புரு DNA உடன் நிரப்பும் மகள் strand DNA வை இன் விட்ரோ ரெப்ளிகேட் செய்யும் செயல்முறையானது விட்ரோவில் எந்த இலக்கு டிஎன்ஏவையும் விரைவாகவும் குறிப்பாகவும் பெருக்க முடியும்.
1. ஹாட் ஸ்டார்ட் பிசிஆர்
வழக்கமான PCR இல் பெருக்கத்தின் தொடக்க நேரம் PCR இயந்திரத்தை PCR இயந்திரத்தில் வைப்பது அல்ல, பின்னர் நிரல் பெருக்கத் தொடங்குகிறது.கணினி உள்ளமைவு முடிந்ததும், பெருக்கம் தொடங்குகிறது, இது குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும், மேலும் சூடான-தொடக்க PCR இந்த சிக்கலை தீர்க்க முடியும்.
சூடான தொடக்க PCR என்றால் என்ன?எதிர்வினை அமைப்பு தயாரிக்கப்பட்ட பிறகு, என்சைம் மாற்றியானது எதிர்வினையின் ஆரம்ப வெப்ப நிலை அல்லது "ஹாட் ஸ்டார்ட்" கட்டத்தில் அதிக வெப்பநிலையில் (பொதுவாக 90 ° C க்கும் அதிகமாக) வெளியிடப்படுகிறது, இதனால் DNA பாலிமரேஸ் செயல்படுத்தப்படுகிறது.சரியான செயல்படுத்தும் நேரம் மற்றும் வெப்பநிலை டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் மற்றும் ஹாட்-ஸ்டார்ட் மாற்றியின் தன்மையைப் பொறுத்தது.இந்த முறை முக்கியமாக டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயல்பாட்டைத் தடுக்க ஆன்டிபாடிகள், அஃபினிட்டி லிகண்ட்ஸ் அல்லது ரசாயன மாற்றிகள் போன்ற மாற்றிகளைப் பயன்படுத்துகிறது.டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் செயல்பாடு அறை வெப்பநிலையில் தடுக்கப்படுவதால், பிசிஆர் எதிர்வினைகளின் தனித்தன்மையை இழக்காமல் அறை வெப்பநிலையில் பல பிசிஆர் எதிர்வினை அமைப்புகளைத் தயாரிப்பதற்கு ஹாட் ஸ்டார்ட் தொழில்நுட்பம் பெரும் வசதியை வழங்குகிறது.
2. RT-PCR
ஆர்டி-பிசிஆர் (ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பிசிஆர்) என்பது எம்ஆர்என்ஏவில் இருந்து சிடிஎன்ஏவில் இருந்து ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் பெருக்கத்திற்கான டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்துவதற்கான ஒரு சோதனை நுட்பமாகும்.முதலில் திசுக்கள் அல்லது உயிரணுக்களில் மொத்த ஆர்என்ஏவை பிரித்தெடுத்தல், ஒலிகோவை (டிடி) ஒரு ப்ரைமராகப் பயன்படுத்துதல், சிடிஎன்ஏவை ஒருங்கிணைக்க ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைப் பயன்படுத்துதல், பின்னர் இலக்கு மரபணுவைப் பெற அல்லது மரபணு வெளிப்பாட்டைக் கண்டறிவதற்காக பிசிஆர் பெருக்கத்திற்கான டெம்ப்ளேட்டாக சிடிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்துதல்.
3. ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR
ஃப்ளோரசன்ட் அளவு PCR (நிகழ் நேர அளவு PCR,RT-qPCR) பிசிஆர் எதிர்வினை அமைப்பில் ஃப்ளோரசன்ட் குழுக்களைச் சேர்க்கும் முறையைக் குறிக்கிறது, ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னல்களின் திரட்சியைப் பயன்படுத்தி முழு PCR செயல்முறையையும் உண்மையான நேரத்தில் கண்காணிக்கவும், இறுதியாக நிலையான வளைவைப் பயன்படுத்தி டெம்ப்ளேட்டை அளவுரீதியாக பகுப்பாய்வு செய்யவும்.பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் qPCR முறைகளில் SYBR Green I மற்றும் TaqMan ஆகியவை அடங்கும்.
4. உள்ளமை PCR
நெஸ்டட் பிசிஆர் என்பது இரண்டு சுற்று பிசிஆர் பெருக்கத்திற்கு இரண்டு செட் பிசிஆர் ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துவதைக் குறிக்கிறது, மேலும் இரண்டாவது சுற்றின் பெருக்கத் தயாரிப்பு இலக்கு மரபணு துண்டு ஆகும்.
முதல் ஜோடி ப்ரைமர்களின் (அவுட்டர் ப்ரைமர்கள்) பொருத்தமின்மை ஒரு குறிப்பிட்ட அல்லாத தயாரிப்பை பெருக்கினால், அதே குறிப்பிட்ட அல்லாத பகுதியை இரண்டாவது ஜோடி ப்ரைமர்கள் அங்கீகரித்து தொடர்ந்து பெருக்குவதற்கான சாத்தியக்கூறு மிகக் குறைவு, எனவே இரண்டாவது ஜோடி ப்ரைமர்கள் மூலம் பெருக்கம், PCR இன் தனித்தன்மை மேம்படுத்தப்பட்டுள்ளது.இரண்டு சுற்றுகள் PCR செய்வதன் ஒரு நன்மை என்னவென்றால், அது வரையறுக்கப்பட்ட தொடக்க டிஎன்ஏவில் இருந்து போதுமான உற்பத்தியை பெருக்க உதவுகிறது.
5. டச் டவுன் பிசிஆர்
டச் டவுன் பிசிஆர் என்பது பிசிஆர் சுழற்சி அளவுருக்களை சரிசெய்வதன் மூலம் பிசிஆர் எதிர்வினையின் தனித்துவத்தை மேம்படுத்துவதற்கான ஒரு முறையாகும்.
டச் டவுன் பிசிஆரில், முதல் சில சுழற்சிகளுக்கான அனீலிங் வெப்பநிலை, ப்ரைமர்களின் அதிகபட்ச அனீலிங் வெப்பநிலையை (டிஎம்) விட சில டிகிரிக்கு மேல் அமைக்கப்படுகிறது.அதிக அனீலிங் வெப்பநிலையானது குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தை திறம்பட குறைக்கலாம், ஆனால் அதே நேரத்தில், அதிக அனீலிங் வெப்பநிலை ப்ரைமர்கள் மற்றும் இலக்கு வரிசைகளின் பிரிப்பை மோசமாக்கும், இதன் விளைவாக PCR விளைச்சல் குறைகிறது.எனவே, முதல் சில சுழற்சிகளில், அமைப்பில் இலக்கு மரபணுவின் உள்ளடக்கத்தை அதிகரிக்க, ஒரு சுழற்சிக்கு 1 டிகிரி செல்சியஸ் அனீலிங் வெப்பநிலை பொதுவாகக் குறைக்கப்படும்.அனீலிங் வெப்பநிலை உகந்த வெப்பநிலைக்கு குறைக்கப்படும் போது, மீதமுள்ள சுழற்சிகளுக்கு அனீலிங் வெப்பநிலை பராமரிக்கப்படுகிறது.
6. நேரடி PCR
நேரடி PCR என்பது நியூக்ளிக் அமிலம் தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு தேவையில்லாமல் நேரடியாக மாதிரியிலிருந்து இலக்கு டிஎன்ஏவின் பெருக்கத்தைக் குறிக்கிறது.
நேரடி PCR இல் இரண்டு வகைகள் உள்ளன:
நேரடி முறை: ஒரு சிறிய அளவு மாதிரியை எடுத்து, PCR அடையாளத்திற்காக நேரடியாக PCR மாஸ்டர் கலவையில் சேர்க்கவும்;
விரிசல் முறை: மாதிரியை மாதிரி எடுத்த பிறகு, அதை லைசேட்டில் சேர்த்து, ஜீனோமை வெளியிட லைஸ் செய்து, சிறிதளவு லைஸ்டு சூப்பர்நேட்டன்ட்டை எடுத்து PCR மாஸ்டர் மிக்ஸில் சேர்த்து, PCR ஐ அடையாளம் காணவும்.இந்த அணுகுமுறை சோதனைப் பணியை எளிதாக்குகிறது, நேரத்தை குறைக்கிறது மற்றும் சுத்திகரிப்பு நடவடிக்கைகளின் போது டிஎன்ஏ இழப்பைத் தவிர்க்கிறது.
7. SOE PCR
மேல்படிப்பு நீட்டிப்பு PCR (SOE PCR) மூலம் மரபணு பிரித்தல், PCR தயாரிப்புகளை ஒன்றுடன் ஒன்று சங்கிலிகளை உருவாக்குவதற்கு நிரப்பு முனைகளுடன் கூடிய ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துகிறது, இதனால் அடுத்தடுத்த பெருக்க வினையில், ஒன்றுடன் ஒன்று சங்கிலிகளின் நீட்டிப்பு மூலம், A நுட்பத்தின் வெவ்வேறு ஆதாரங்கள் பெருக்கப்பட்ட துண்டுகள் ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்க்கப்படுகின்றன. மற்றும் ஒன்றாக பிரிக்கப்பட்டது.இந்த தொழில்நுட்பம் தற்போது இரண்டு முக்கிய பயன்பாட்டு திசைகளைக் கொண்டுள்ளது: இணைவு மரபணுக்களின் கட்டுமானம்;மரபணு தளம் சார்ந்த பிறழ்வு.
8. ஐ.பி.சி.ஆர்
தலைகீழ் பிசிஆர் (ஐபிசிஆர்) இரண்டு ப்ரைமர்களைத் தவிர மற்ற டிஎன்ஏ துண்டுகளை பெருக்க தலைகீழ் நிரப்பு ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துகிறது, மேலும் அறியப்பட்ட டிஎன்ஏ துண்டின் இருபுறமும் அறியப்படாத வரிசைகளை அதிகரிக்கிறது.
ஐபிசிஆர் முதலில் அருகிலுள்ள அறியப்படாத பகுதிகளின் வரிசையை தீர்மானிக்க வடிவமைக்கப்பட்டது, மேலும் பெரும்பாலும் மரபணு ஊக்குவிப்பாளர் வரிசைகளை ஆய்வு செய்ய பயன்படுத்தப்படுகிறது;மரபணு இணைவு, இடமாற்றம் மற்றும் இடமாற்றம் போன்ற புற்றுநோயியல் குரோமோசோமால் மறுசீரமைப்புகள்;மற்றும் வைரஸ் மரபணு ஒருங்கிணைப்பு, இப்போது பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது தளம்-இயக்கப்படும் பிறழ்வுகளுக்கு, விரும்பிய பிறழ்வுடன் பிளாஸ்மிட்டை நகலெடுக்கவும்.
9. டிபிசிஆர்
டிஜிட்டல் பிசிஆர் (டிபிசிஆர்) என்பது நியூக்ளிக் அமில மூலக்கூறுகளின் முழுமையான அளவீட்டுக்கான ஒரு நுட்பமாகும்.
நியூக்ளிக் அமில மூலக்கூறுகளை அளவிடுவதற்கு தற்போது மூன்று முறைகள் உள்ளன.ஃபோட்டோமெட்ரி நியூக்ளிக் அமில மூலக்கூறுகளின் உறிஞ்சுதலை அடிப்படையாகக் கொண்டது;நிகழ்நேர ஒளிரும் அளவு PCR (Real Time PCR) என்பது Ct மதிப்பை அடிப்படையாகக் கொண்டது, மேலும் Ct மதிப்பு என்பது கண்டறியக்கூடிய ஒளிர்வு மதிப்புடன் தொடர்புடைய சுழற்சி எண்ணைக் குறிக்கிறது;டிஜிட்டல் PCR என்பது நியூக்ளிக் அமில அளவை கணக்கிடுவதற்கான ஒற்றை மூலக்கூறு PCR முறையை அடிப்படையாகக் கொண்ட சமீபத்திய அளவு தொழில்நுட்பமாகும்.
இடுகை நேரம்: ஜூன்-13-2023